Producción de hemólisis

 Objetivo:

En esta práctica vamos a ver las distintas especies del género Streptococcus que producen hemólisis cuando crecen en un medio de agar sangre. Hay 3 tipos de actividad hemolítica:

- alfa- hemólisis: halo de color verdoso alrededor de la colonia.

-beta-hemólisis: halo transparente alrededor de la colonia.

-gamma-hemólisis: ausencia de hemólisis.

 Esta prueba bioquimica se emplea para diferenciar los distintos tipos de hemolisis

Materiales:

- Asa de siembra

- Mechero bunsen

- Placa agar sangre

- Muestra de microorganismos que vamos a sembrar

Procedimiento:

-1: Primero tenemos que sembrar la muestra en placas de agar sangre

- 2: A continuación incubamos 24-48 horas a 37ºC en la estufa

-3: Por último observamos la aparición de alfa, beta o gamma hemólisis que presenta la placa

Galería:

Prueba bioquímica: Fermentación de manitol

Prueba bioquímica: Fermentación de manitol

 Objetivo:

 En esta práctica vamos a intentar identificar una serie de micro organismo empleando una prueba bioquímmiaca llamada fermentación de manitol. Vamos a estudiar la capacidad que tiene este microorganismo para fermentar el manitol, en presencia de una gran concentración de Nacl. Diferenciaremos entre S. aereus del resto de estafilococos

 Materiales:

- Placas de petri con medio manitol

- Asas de siembra

- Mecheros bunsen

- Microorganismo de muestra

 Procedimiento:

 -1: Primero cogemos el equipo necesario para poder obtener las colonias de la placa de muestra

 -2: Después esterilizamos el asa y cogemos la colonia aislada

 -3: Hacemos una siembra por agotamiento por estrías en la placa que contiene el manitol.

 -4: Volvemos a esterilizar el asa de siembra con el mechero, para eliminar cualquier M.O. resistente

 -5: Ahora tenemos que incubar la placa de manitol en la estufa durante unos dias

 -6: Por último, tras pasar este periodo de tiempo, observamos las placas y vemos como a fermentado y si el color del manito a cambiado

 Resultado:

 Tras haber hecho las prácticas si el M.O. empleando es positivo, habrá cambiado el color de la placa de rosa a amarillo ya que habrá fermentado totalmente, además veremos las colonias bacterianas que han crecido

 Galería:

Prueba bioquímica: Coagulasa (en tubo)

Prueba bioquímica: Coagulasa (en tubo)

 Objetivo:

En esta práctica vamos a realizar una prueba bioquimica denominada coagulasa. Para estudiar la capacifad del microorganismo para producir enzima coagulasa que forma la coagulación del plasma. Gracias a esta técnica podemos distinguir entre S.aereus (+) y estafilococo (-)

 Materiales:

- Tubo de ensayo

- Plasma de citrato

- Asa de siembra

- Estufa para incubar

 Procedimiento:

-1: Primero cogemos la muestra con la que vamos a trabajar

-2: Luego tenemos que emulsionar las colonias en un tubo de ensayo que tenga 0,5 mL de plasma citratato

- 3: Después incubar la a 37 grados durante 4 horas

- 4: Por último tras haber pasado este periodo tenemos que ve el resultado de la prueba

 Resultado:

Tras haber hecho estos procedimientos el resultado sera; que si es + se observa la formación de un coágulo; no obstante si es - se reincubará toda la noche y volvemos a hacer la lectura

 Galería:

Prueba bioquímica: Sensibilidad a la optoquina

Prueba bioquímica: Sensibilidad a la optoquina

 Objetivo:

 En esta práctica vamos a intentar diferenciar S. pneuomoniae, que es sensible a la optoquina, comparándolo con otros estrptococos que son resistentes

 Materiales:

- Placa de petri

- Asa de siembra

- Mechero bunsen

- Agua destilada

- Pinzas estériles

- Disco de optoquina

 Procedimiento:

 -1: Se siembra una placa de agar sangre, empleando un sembrado por estrías

-2: Ahora colocamos en el centro de la zona sembrada, con unas pinzas estériles, un disco de optoquina

-3: Después añadimos una gota de H2O destilada

-4: Por último incubamos la placa invertida durante 24H a 37 grado

Resultado:

Tras haber hecho estas prácticas podemos ver el resultado final. Si el M.O. es sensible a esta prueba, aparecerá un halo de inhibición alrededor del disco de optoquina

 Galería:

Tinción de tinta china

Tinción de tinta china

 Objetivo:

En esta práctica vamos a intentar hacer una tinción de las cápsulas de una bacteria, empleando las técnicas ya aprendidas, pero esta vez utilizando un colorante distinto llamado tinta china o nigrosina

 Materiales:

-Asa de siembra

- Mechero bunsen

- Portaobjetos

- Barras paralelas

- Microscopio

- Agua destilada

- SSF estéril

 Procedimiento:

- 1: En primer lugar vamos a preparar los portas para la tinción, por lo que tenemos que hacer la extensión y desecación; no obstante esta vez no es necesario que fijemos la muestra

- 2: Ahora tenemos que verter la fucsina durante 2 minutos

- 3: Cuando haya pasado este periodo de tiempo lavamos la muestra con agua destilada, para eliminar restos de colorantes y la dejamos secar

- 4: Después, colocamos una gota de nigrosina en un extremos del porta, y con otro lo extendemos con cuidado, como cuando hacemos una extensión en hematología

- 5: Por último secamos el porta a temperatura ambiente y lo vemos usando un microscopio, recordando que necesitamos aceite de inmersión

 Resultado:

Tras haber hecho la práctica, se puede apreciar que sobre un fondo negro se observan los microorganismos teñidos de rojo y la cápsula como un halo blanco que los rodea

Galería:

Tinción ácido-alcohol resistente: ziehl neelsen

Tinción ácido-alcohol resistente: ziehl neelsen

 Objetivo:

 En esta práctica vamos a determinar la ácido alcohol resistencia de las micobacterias de una muestra. Para ello vamos a emplear las técnicas ya mencionadas y otras nuevas como son someter la muestra a gases de una llama para así facilitar la tinción.

Materiales:

- Porta

- Fucsina fenicada

- Decolorante (Alcohol ácido)

- Azul de metileno

- Aceite de inmersión

- Fuente de calor

- Microorganismo (M. Phlei)

 Procedimiento:

 -1: En primer lugar, como siempre vamos a preparar el porta y la muestra que vamos a emplear, por lo que tenemos que hacer la extensión

-2: A continuación vamos a fijar la muestra en el porta

-3 : Ahora pasamos a la tinción, siguiendo los estos paso;

     3.1; En primer lugar para conseguir la tinción vamos a cubrir la preparación con fucsina fenicada, durante un minuto

     3.2; Colocamos ahora sobre las preparaciones un papel de filtro y añadimos la fucsina. Mientras tenemos que suministrar la emisión de vapores por lo que cogeremos un algodón empapado en alcohol y le prendemos fuego, colocando este debajo de los portas. Todo esto durante un total de 5 minutos

     3.3; Después vamos a lavar las preparaciones con agua, eliminando así cualquier rasto de colorante

     3.5; A continuación hacemos una decoloración con alcohol ácido (30 segundos) hasta eliminar el color rojizo

     3.6; Hacemos la tinción de contraste empleando azul de metileno con una duración de 1-2 mins.

     3.7; Por último enjuagamos los portas y secamos los portas a temperatura ambiente. Para después verlos empleando un microscopio con aceite de inmersión 

Resultado:

 Si hemos hecho bien la práctica podremos ver por el microscopio un tono azul y con las bacterias de color azul más oscuro si no son resistentes, pero las resistentes se ven de color rojo. La muestra a de ser uniforme en la extensión y con un grosor adecuado

 Galería:

Tinción de cápsulas por el método de Anthony

Fundamento:

En esta práctica vamos a hacer estructural que sirve para poder apreciar las cápsulas de unas bacterias. La cápsula bacteriana es la capa con borde definido formada por una serie de polímeros orgánicos que le sirve a las bacterias de cubierta protectora resistiendo la fagocitosis. Estas tinciones pueden teñir estructuras que sólo están presentes en algunas especies y, por lo tanto, sirven como criterio de identificación.

Material:

-Asa de siembra

- Mechero bunsen

- Portaobjetos

- Barras paralelas

- Microscopio

- Agua destilada

- SSF estéril

- Cristal violeta al 1%

- Sulfato de cobre al 20%

- Cultivo de 24h de una bacteria capsulada

Procedimiento:

Esta tinción se realiza sobre extensiones secadas a tª ambiente, por lo que no habrá que fijarla.

-1: Lo primero que haremos será teñir la extensión con cristal violeta al 1% durante 1 minuto.

-2: A continuación lavamos con solución saturada de sulfato de cobre al 20%.

-3: Por último tenemos que secar al aire la muestra y observar al microscopio

Resultado:

 Tras haber realizado estos procedimientos, podemos obser que a aparecido un halo transparente azulado (la cápsula) alrededor de la bacteria que se verá teñida de color rosa o rojo.

 Galería:

Tinción simple (Bacteria del yogurt y sarro dental)

Tinción simple (Bacteria del yogurt y sarro dental)

 Objetivo:

 En esta práctica vamos a realizar una tinción de la muestra que hemos preparado en la práctica anterior, utilizaremos en un porta una muestra conseguido de un yogurt y en otro porta una muestra de sarro cogido de uno de nosotros en ese mismo momento

 Materiales:

 • Asa de platino

 • Mechero Bunsen

 • Portaobjetos

 • Muestras bacterianas de origen natural

 • Colorantes para tinción

 Procedimiento (Bacteria del yogurt):

-1: Sobre un portaobjetos realizar la extensión,usando una porción de yogur, empleando un asa de siembra previamente flameada.

-2: Secar al aire

-3: Fijar con calor pasando

-4: Teñir con un colorante durante 1‐2 minutos (cristal violeta, safranina, azul de metileno, etc.).

-5: Secar la preparación

-6: Observar con 100x, poniendo aceite de inmersión.

 Procedimiento (Bacteria del sarro):

-1: Con un asa de siembra, que hayamos esterilizado, empleando el mechero, ponemos una gota de agua estéril sobre un portaobjetos limpio

-2: Flamear de nuevo el asa.

-3: Con un hisopo estéril tomar un poco de sarro, lo suspendemos y homogeneizamos con la gota de agua y realizar la extensión

-4: Secar al aire

-5: Fijar con calor pasando, tres veces, el porta sobre la llama del mechero.

-6: Teñir con un colorante durante 1‐2 minutos.

-7:Secar la preparación

-8: Observar con 100x, recordando que hay que usar aceite de inmersión

 Galería:

Tinción de gram

Tinción de gram

 Objetivo:

 En esta práctica vamos a realizar otro tipo de tinción diferente, que además es la más importante de todas ya que se emplea para diferenciar entre las bacterias Gran (+) y Gram (-), todo esto gracias a sus propiedades de la pared celular

 Materiales:

- Mechero Bunsen

- Portaobjetos

- Asa de platino

- Pipeta Pasteur

- Colorantes de Gram (cristal violeta, lugol, alcohol ‐ acetona, safranina )

- Agua destilada estéril

- Cristalizador, barras paralelas, frasco lavador, microscopio

- Muestra bacteriana

 Procedimiento:

 -1: Lo primero que tenemos que hacer es preparar la extensión de la muestra ( No vamos a profundizar en esta ya que ya lo hemos comentado en prácticas anteriores)

-2: Ahora que dejamos unos minutos la extensión al aire libre, para que así este se seque

-3: Después vamos a hacer la fijación de las bacterias en porta como ya vimos

-4: Por últimos haremos la coloración de la extensión, colocando los portas en las paralelas y hacemos la tinción de gram y seguiremos estos pasos;

     4.1; Cubrimos la preparación con cristal violeta, durante un minuto. Tras pasar este tiempo, lo lavamos con agua destilada

     4.2; Ponemos lugol, con un periodo de 1 min. Y volvemos a lavar con agua destilada

     4.3; Le quitamos el colorante con alcohol-acetona y lavamos con mucha agua para que no quede rastro de alcohol

     4.4; Echamos el colorante que hará de contraste echando safranina (1 min 30 seg) y fusina (2 mins)

     4.5; Tras haber hecho ya todo esto es el momento de lavar con agua destilada, secar y mirar el resultado a través del microscopio empleando aceite de inmersión

 Resultado:

 Si hemos realizado correctamente todo este procedimiento podremos apreciar la morfología de las bacteria que estamos estudiando. Además apreciamos que si usamos bacteria G(+), estas habrán cogido un color azulado; no obstante si la muestra es G(-) el color de las bacterias será morado

 Galería:

Siembra-aislamiento

Objetivo:

 En esta práctica vamos a realizar la técnica de  la siembra, una técnica fundamental para la microbiología. Con el objetivo de conseguir la reproducción de los organismos que vayamos a utilizar y además que también utilizaremos para las pruebas bioquímicas

Material:

- Mechero Bunsen

- Hisopo

- Asa  de platino

- Cultivos bacterianos o muestras

- Medios de cultivo distribuidos en placas de Petri y en tubo

- Gradillas para tubos de ensayo

Procedimiento(Siembra en placa):

-1: Primero tenemos que flamear el asa de siembra y enfriar en las proximidades del mechero.

-2: Luego debemos tomar una muestra del cultivo de microorganismos y extenderla sobre la superficie de una placa Petri que  contenga un medio de cultivo.

-3: A continuación distribuimos la muestra en un área pequeña de la superficie de  la placa, mediante un movimiento en zig‐zag, haciendo  estrías muy juntas, pero sin hacer presión para no dañar el  agar.

 -4: Después flameamos el asa, esperamos a que se enfríe y después de  rozar  la  siembra  realizada  previamente, extender de  nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas  estrías.

 NOTA: Repetimos este proceso sucesivamente flameando y enfriando  el  asa  al  comienzo  de  las  sucesivas siembras en  estría.

-5: Por último incubamos la placa, a la temperatura adecuada  y siempre en posición  invertida. Para obtener las colonias aisladas a partir de  una muestra que contenga  un elevado número de bacterias.

Procedimiento(siembra en tubo):

‐1:Primero flameamos  el asa  de siembra y tomar la muestra; como hicimos con la placa

- 2: Luego quitamos el tapón del tubo, que contiene el medio de cultivo,   cogiéndolo con el dedo meñique de la mano derecha

-3: Después flameamos  la boca del tubo después de abrirlo e introducimos  el  asa de siembra hasta el fondo del tubo y  seguidamente ir  deslizándola, con un  movimiento de zig‐zag, por la superficie del medio desde el fondo hasta la parte por  la superficie del medio desde el fondo  hasta la parte  superior.

-4: Por último volvemos a flamear la boca del tubo antes de poner el tapón, para asegurar que no quedan microorganismo y se flamea el asa.

 Galería:

Preparación de un frotis bacteriano

Preparación de un frotis bacteriano

 Objetivo:

 En esta práctica vamos a intentar preparar un frotis bacteriano para después poder verlo por microscopio, para ello emplearemos técnica como son la fijación y la extensión en porta. Luego podremos teñirla

 Materiales:

 • Asa de platino

 • Mechero Bunsen

 • Portaobjetos

 • Muestras bacterianas de origen natural

 • Colorantes para tinción

 Procedimiento

 -1: En primer lugar tenemos que hacer una extensión en porta de la muestra, para ello haremos lo siguiente;

     1.1. Colocar una gota de agua destilada en el porta.

     1.2. Con el asa de Platino, estéril,pasamos una pequeña cantidad del cultivo bacteriano  a la gota.

     1.3. Remover la mezcla con el asa

    NOTA: Si el material del que hemos empleado es un cultivo en medio líquido, no tenemos que realizar el paso 1.1

- 2: Ahora tenemos que tenemos hecha la extensión, a continuación tendremos que hacer la desecación, dejando la preparación a temperatura ambiente durante un rato

- 3: Por último vamos a hacer la fijación para lograr que las bacterias queden bien adheridas al porta. Esto lo conseguimos haciendo 3 pases del porta por la llama del mechero

 Resultado:

 Gracias a estos procedimientos tenemos la muestra fijada y lista para teñir, algo imprescindible para su posterior estudio

 Galeria:

Fabricación de un medio de cultivo y comprobación de la ubicuidad bacteriana

Fabricación de un medio de cultivo y comprobación de la ubicuidad bacteriana

Objetivo:

 El objetivo de esta práctica es aprender a realizar un medio de cultivo por nosotros mismos para después poder hacer un cultivo bacteriológico en este mismo, además también haremos el primer cultivo bacteriológico del curso utilizando nuestro dedo, ya que vernos la cantidad de bacteria que tenemos en nuestra mano en estado normal, tras habernos lavado las manos con agua y jabón, tras desinfectarnos las manos y por último tras tocar un objeto cualquiera (en mi caso fue el grifo de la fuente de agua)

Materiales:

- 10G de TSA

- 250 mL de agua destilada

- Probeta

- Estufa

- Agitador magnético

Procedimiento:

·1: Tenemos que hacer el medio de cultivo donde creceran las bacterias; para ello haremos lo siguiente

- 1.1: Cogeremos un matraz y en esta hecharemos 100 mL de agua destilada

- 1.2: Hecharemos los 10 G de TSA en polvo, con ayuda de un embudo

- 1.3: Vertemos el resto del agua que nos quedaba y lo mezclamos bien usando un agitador magnético ya que así podemos suministrar temperatura y movimiento a la disolución, dos factores muy importante para hacer las mezclas de disoluciones

·2: Una vez que ya tenemos el medio de cultivo liquido tenemos que hechar un poco de esta disolución en cada placa petri, sin pasarnos ni quedarnos cortos. Y lo metemos en la nevera

·3: Ahora que ha pasado el tiempo suficiente para que el medio se solidifique es hora de sacarlo de la nevera

·4: A continuación tenemos que poner el dedo como hemos descrito previamente en cada porción de la placa que dividimos, recordando; la primera con el dedo sucio, la segunda tras habernos lavado las manos, la tercera después de desinfectar el dedo y la última tras haber tocado un objeto de la cale

·5: Ahora que están las bacterias en las placas; metemos estas en una estufa a 37 grados durante 24H para que así puedan crecer las bacterias

·6: Sacamos las placas y vemos que las bacterias han proliferado y se han formado pequeños círculos en cada porción, cada circulo es una colonia bacteriológica

Resultado:

Tras haber terminado la prueba podemos comprobar que efectivamente hemos conseguido el objetivo propuesto, ya que al haber sacado las placas de las estufas podemos apreciar como tenemos pequeños puntos blancos y amarillos, los cuales corresponden a colonias bacteriológicas ; se puede apreciar que en la primera porción hay más colonias que ninguna en la de las manos lavadas hay pocas y en el tercero con las manos desinfectadas es la que menos tiene, prueba de la eficacia del desinfectante para eliminar las bacterias

Galería: