Pruebas bioquímicas bacilos Gram negativos

Objetivo:

En esta práctica vamos a hacer una serie de pruebas cuyo obsjetivo es la determinación de los bacilos Gram-. Gracias a estas pruebas podremos determinar la especie bacteriana de una muestra problema.

Compuesto por:

     -KLIGLER

Esta prueba permite la diferenciación de enterobacterias. Este medio cuenta con un indicador de pH (rojo fenol) que vira a amarillo cuando el pH es ácido y que toma un color rojo cuando el pH es alcalino. Además tiene la capacidad de detectar la producción de sulfhídrico, volviéndose el fondo negro.

Se toma una colonia de la muestra y se siembra, con el hilo de platino, en picadura en el fondo del tubo y a continuación se siembra en estría sobre la superficie del pico de flauta (también con el hilo de platino).Se incuban a 37ºC durante 24 h.

Los M.O. que aparezcan en este medio, serán: lactosa +/ glucosa +/ producción de gases - y sulfhídrico -

   -IMVIC

Las pruebas INVIC (INDOL, ROJO DE METILO, VOGES-PROSKAUER Y CITRATOS) es un conjunto de 4 pruebas diferentes. Se emplean fundamentalmente para la identificación de las Enterobacterias

·Producción de Indol

Es capaz de identificar si la bacteria posee la enzima (triptofanasa). Esta prueba requiere de un reactivo específico (Reactivo de Kovacs).

Tenemos que Inocular el medio de cultivo (agua de peptona).Incubar a 37 ºC durante 48 horas A las 24-48 horas, añadir unas gotas de reactivo de Kovacs. Agitar y dejar reposar el cultivo.

El resultado es negativo.

Un resultado positivo se detecta mediante la formación de un anillo rosa en la superficie, después de añadir el reactivo de Kovacs.

·Rojo metilo

Tiene la capacidad de detectar la fermentación ácido-mixta. Se acumulan ácidos (acético, fórmico, etc.), relativamente fuertes y bajan el pH del medio hasta 4-5. Dicho cambio de pH se detecta añadiendo un indicador (rojo de metilo) al cultivo.

 Inocular el medio de Clark-Lubs. Incubar a 37 oC durante 48 horas. Añadir unas gotas de rojo de metilo (rojo a pH 4-5; amarillo a pH>6)

El resultado sería positivo.

·Voges-Proskauer

Tiene la capacidad de detectar la fermentación butanodiólica. Necesita un reactivo especial, (alfa-naftol y KOH al 40%), se detecta la presencia de un precursor del butanodiol (acetilmetilcarbinol o acetoína). La acetoína en presencia de oxígeno se oxida a diacetilo. El diacetilo origina una coloración roja al reaccionar con los restos guanidínicos de algunos aminoácidos de la peptona del medio.

El medio de cultivo, es el mismo que en la prueba del rojo de metilo.

El procedimiento que se lleva a cabo para emplear esta prueba es; inocular el medio de Clark-Lubs. Incubar a 37 ºC durante 24- 48 horas. Añadir unas gotas alfa-naftol. Agitar y añadir KOH. Agitar. Lectura 15 minutos.

La prueba será positiva si en 20 minutos aparece una coloración roja.

En nuestro caso el resultado es negativo.

   -Consumo de citratos

Se determina la utilización del citrato como única fuente de carbono y energía. Se utiliza el medio de Simmons: utiliza un medio sólido con citrato sódico y un indicador ácido-base (azul de bromotimol). En este caso se detecta la alcalinización del medio por el consumo del citrato.

Inocular el medio: El medio de Simmons es sólido, y se siembra por estría con asa de platino. Incubar a 37 ºC durante 24-48 horas.

Como el medio no ha virado a azul se considera negativa.

  -Test de la urea

Esta prueba se utiliza para diferenciar a los microorganismos capaces de hidrolizar la urea por la acción del enzima ureasa. Este enzima al hidrolizar la urea (H2N-CO-NH2) origina amoníaco, el cual produce un incremento del pH del medio que puede detectarse mediante un indicador (rojo fenol).

 El test de la urea se realizar sobre un medio que lleva urea y un indicador de pH (rojo fenol), que por encima de pH 8,4 vira de amarillo a rosa. Se puede utilizar:

Un medio sólido, en pico de flauta, contenido en un tubo, como puede ser el Agar urea de Christensen. O un medio líquido como el Caldo urea indol.

No se ha producido viraje de color por lo que el resultado se considerará negativo.

Galería: