Coprocultivo

Objetivo:

En esta práctica vamos a realizar un coprocultivo, emplearemos heces como muestra heces recogidas ese mismo dia. Las muestras de heces deben procesarse lo más rápidamente posible, deben estar en el laboratorio antes de una hora para su procesado, o, en caso contrario, se mantendrán a 4ºC.

Materiales:

-Hisopo de algodón

-Mechero Bunsen

-Estufa

-Suero salino fisiológico estéril

-Agar S-S (Salmonella-Shigella)

-Agar Hektoen

-Agar Columbia

-Agar Sabouraud

-Caldo Selenito

Procedimiento:

Como las heces son sólidas se realiza una suspensión densa, en 2’5 ml de solución salina estéril,hacemos una dilución tomando una porción de heces del tamaño de un guisante y agitando hasta su homogeneización. La siembra debe realizarse casi de inmediato pues algunos patógenos intestinales. La siembra se realiza haciendo una estría, con el hisopo, desde un borde hasta la mitad de la placa. A continuación con un asa de siembra estéril, se siembra por agotamiento de estrías en el resto de la placa.

Por último, se introduce el hisopo en el caldo selenito o tetrationato, agitándolo ligeramente

Incubar las placas y el caldo a 37°C durante 24 horas.

Al día siguiente, se realiza una resiembra del caldo en agar S-S (ó HK). Para ello, con un asa estéril se toma una cantidad del caldo y se siembra.

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Urocultivo

Objetivo:

En esta práctica vamos a realizar un urocultivo, que es un cultivo que se realiza para detectar la presencia bacteriana en orina.

Materiales:

-Mechero bunsen.

-Orina de la mañana (o inóculo bacteriano).

-Medio Cled.

-Medio McConkey.

-Medio EMB Levine.

-Asa de plástico calibrada de 10 μL.

-Asa de platino.

-Estufa.

Procedimiento:

Es importante que siempre trabajemos en un medio estéril, en nuestro caso cerca de un mechero Bunsen.

Siembra en medio Cled: con el asa calibrada, introducirla en la orina y tomar una muestra. Hacer una estría desde el borde hasta el centro de la placa, y a partir de ella, estriar perpendicularmente de derecha a izquierda, luego realizar dos firmas.

Siembra en medio McConkey: con el asa de platino, hacer una siembra por agotamiento de estrías.

Siembra en medio EMB: igual que el anterior, por agotamiento de estrías con asa de platino.

Incubar en la estufa a 37ºC durante 24 horas.

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Antibiograma

Objetivo:

En esta práctica vamos a realizar un antibiograma; se denomina así al conjunto de técnicas, empleadas en el laboratorio, para determinar el grado de sensibilidad de los microorganismos frente a unos antimicrobianos. Emplearemos el método de difusión en agar o método de Kirby-Bauer

Este método consiste en colocar discos de diferentes antibióticos, sobre placa Petri que contiene el agar con el microorganismo y tras un periodo de incubación de 18-24 horas, observar la zona o halo de inhibición que aparece rodeando al disco de antibiótico.

Materiales:

-Asa de siembra

-Hisopo de algodón

-Suero fisiológico

-Inóculo bacteriano

-Medio Müeller-Hinton

-Discos con antibiótico

Procedimiento:

Se prepara un cultivo de 18 horas, de las bacterias que hay que ensayar, en agar tripticasa soja (TSA)

Realizamos un inóculo bacteriano, con una turbidez de 0,5 de la escala de McFarland, cogiendo unas 3-4 colonias y las resuspenderemos en 3-4 ml de suero.

Sumergir, en el inóculo, un hisopo de algodón y eliminar el exceso presionándolo sobre la pared interna del tubo que lo contiene y por encima del nivel del caldo de cultivo.

Inocular la superficie de una placa de agar de Müeller-Hinton con el hisopo, pasándolo uniformemente por toda la superficie en tres direcciones. Por último pasar el hisopo por el reborde la placa de agar. Dejar secar 5 minutos.

Con unas pinzas estériles, colocar los discos de antibiótico sobre la superficie del agar apretándolos suavemente.

Incubar la placa en posición invertida a 37° C durante 18-24 horas.

Medir los diámetros de las zonas de inhibición con una regla.Los discos que hemos utilizado han sido:

Cephalotina
Vancomicina
Cloramphenicol
Amoxicilina
Ampicilina

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API 20E

Descripción

La batería de pruebas API20E es un sistema de identificación rápida para bacterias de la familia Enterobacteriaceae y otras bacterias Gram (-). Consta de 21 test bioquímicos estandarizados y miniaturizados y una base de datos. Cuya ventajas de ser rápido, eficaz y de permitir realizar numerosas pruebas a la vez. Cada tira de API 20E contiene 20 microtubos o pocillos con distintos sustratos deshidratados. Cada tubo es una prueba bioquímica distinta.

Los microtubos se inoculan con una suspensión de microorganismos, en agua o solución salina, que rehidrata los medios. Las tiras o galerías se incuban a 37°C y por efecto del metabolismo bacteriano se producen cambios de color espontáneos o bien por la adicción de reactivos.

Para hacer la lectura de las reacciones tenemos que comparar con una tabla de lectura donde se indica si los microorganismos deben considerarse positivos o negativos para cada reacción según el color aparecido.

Procedimiento:

En primer lugar tenemos que preparar una suspendión homogenea por lo que vamos a tomar una colonia bien aislada de cada microorganismo y resuspenderla homogéneamente en 5 mL de solución salina

Llenar con la suspensión de bacterias los tubos, no la cúpula, de todos los pocillos.

Llenar la cúpula de los pocillos CIT , VP, GEL con la suspensión de bacterias.

Llenar con parafina las cúpulas de los pocillos ADH, LDC, ODC, URE, H2S para obtener anaerobiosis.

Poner la tira en su propia cámara húmeda de incubación. Previamente poner agua en los alvéolos de la cámara para proporcionar una atmósfera húmeda durante la incubación.

Incubar a 37 °C durante 18-24 h.

La lectura de los resultados se lleva a cabo por comparación de los colores de cada pocillo con los de las tablas de lectura. En caso de que 3 o más ensayos,resultasen positivos, anotar en la hoja de resultados todas las reacciones espontáneas y después revelar los ensayos que necesitan la adición de reactivos:

TDA: Añadir una gota de FeCl3 10 %. Positivo = color marrón oscuro.

VP: Añadir una gota del reactivo 1 (KOH al 40%) y una gota del reactivo 2 (C2 H5 OH). Positivo = color rosa fuerte o rojo en 5 minutos.

Oxidasa: Añadir una gota del reactivo (tetrafenilendiamina) recién preparado. Positivo = color azul que aparece inmediatamente

Glu: Prueba de reducción de nitratos a nitritos (NO2) y en nitrógeno (N2).

Añadir una gota de los reactivos NIT 1 y NIT 2 en el tubo GLU y esperaramos 2 minutos.

Una coloración roja indica una reacción positiva. Si no vira, se añade un poco de zinc y se observa si aparece color o permanece incoloro.

Resultado:

Del conjunto de reacciones y resultados se obtiene un perfil numérico de 7 cifras. Los pocillos están separados en grupos de tres: en total tenemos 7 grupos de tres tubos o tripletes. A cada pocillo se le da el valor 0, 1, 2 o 4.

Si la reacción es negativa se pone 0. Si la reacción es positiva se pone: 1 si es el primer pocillo de un triplete, 2 si es el segundo, 4 si es el tercero. Se suman los valores de cada triplete y se obtiene un código de 7 cifras. Con este código se busca en la tabla de identificación la especie de que se trata.

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